Hikaye, geçmişte yaşanan gizli bir savaşa odaklanır. Ana karakterimiz, genç bir suikastçı olan Ezio Auditore da Firenze'dir. Ezio, 15. yüzyılda İtalya'da bir ailenin parçasıdır. Ancak, ailesi haksız yere suçlanır ve öldürülür.
Bu trajik olayın ardından, Ezio, intikam ateşiyle yanmaktadır. Bir suikastçı olmayı öğrenmek ve ailesinin ölümünden sorumlu olanları bulmak için gizli bir suikastçı örgütüne katılır. Ezio'nun hikayesi, suikastçılar ve Tapınakçılar arasındaki savaşın merkezinde yer alır.
Ezio'nun yolculuğu, İtalya'nın tarihi şehirlerinde geçer. Floransa, Venedik ve Roma gibi yerleri keşfederken, gizli örgütün Tapınakçılarla olan mücadelesinde yer alır. Ezio, Tapınakçılarla çeşitli savaşlara girer, komploları ortaya çıkarır ve suikast görevlerini yerine getirir.
Hikaye boyunca, Ezio'nun karakteri derinleşir ve yetenekleri artar. İtalya'nın büyük liderleriyle karşılaşır, Leonardo da Vinci gibi tarihi figürlerle işbirliği yapar ve suikastçı becerilerini ustalaştırır. Ezio'nun amacı, adaleti sağlamak ve ailesinin ölümünden sorumlu olanlara ulaşmaktır.
Ancak Ezio, sadece kişisel intikamın ötesinde bir savaşın içine çekilir. Tapınakçılar, insanlık tarihini şekillendiren güçlere sahip olan Gizemli Elma'yı ele geçirmek için her şeyi yapmaktadır. Ezio, Elma'nın gücünü anlamak ve kötüye kullanılmasını önlemek için tehlikeli bir yolculuğa çıkar.
Son görevde, Ezio, Tapınakçı lideriyle yüzleşir ve final bir savaşa dönüşür. Ezio'nun cesareti ve yetenekleriyle, düşmanını alt etmeyi başarır ve adaleti sağlar. Ancak Ezio'nun görevi bitmemiştir. Tarihin farklı dönemlerinde başka suikastçılarla ve Tapınakçılarla karşılaşacak ve onlarla mücadele edecektir.